一、實驗目的
本實驗開展微生物長時間連續發酵培養，設置每2 h定時取樣，借助芬蘭Kibron‑Epsilon動態界麵張力儀以及Delta‑8高通量表麵張力分析儀監測發酵上清動態表麵張力、油水界麵張力隨發酵時長的變化，得到完整的發酵動力學界麵活性曲線。
微生物在生長周期的延滯期、對數期、穩定期、衰亡期代謝分泌胞外多糖、生物表麵活性劑、脂蛋白等兩親性物質，界麵張力可以直觀反映胞外活性物質的合成、累積、分解全過程。每隔2 h高頻取樣檢測，能夠精準定位表麵活性劑開始合成、到達峰值、後期降解對應的發酵時間節點，確定產表活最佳發酵周期，為後續發酵工藝優化提供界麵參數依據。
二、實驗前期準備
1.儀器與耗材準備
核心儀器：芬蘭Kibron‑Epsilon動態界麵張力儀用於單份樣品精細測定動態吸附曲線；Delta‑8高通量表麵張力分析儀用於大批量每2 h采集樣品的快速篩查；配置Wilhelmy合金探針、帕爾貼恒溫樣品基座、石英微量樣品杯、96孔低吸附微孔板、探針火焰清潔組件、配套數據采集軟件。
輔助設備：恒溫振蕩搖床、超淨工作台、高速冷凍離心機、pH計、0.22 μm水係濾膜、超聲清洗儀、無菌離心管、一次性無菌取樣管、計時器。
實驗耗材：目標產表麵活性劑微生物菌株、滅菌液體發酵培養基、磷酸鹽緩衝液、酸堿調節試劑、18.2 MΩ超純水、無水乙醇、異丙醇。
儀器預處理規範
整機通電預熱30 min，檢測溫度設置和微生物發酵溫度保持一致，整場動力學檢測溫度固定不變。
Wilhelmy金屬探針每次樣品檢測之前使用丁烷火焰灼燒，清除探針上附著的黏性胞外代謝殘留物，放置恒溫台麵冷卻之後開展零點校準；純水表麵張力穩定維持71.8~72.2 mN/m，基線連續30 min波動小於0.2 mN/m之後方可正式檢測。
石英樣品杯、微孔板依次經過異丙醇擦拭、無水乙醇衝洗、超純水多次潤洗之後氮氣吹幹；操作過程手部不要觸碰容器內壁，避免油脂汙染氣‑液界麵。儀器安置在減震台麵，閉合防風防護罩，隔絕氣流震動以及空氣流動帶來的水分蒸發。
2.發酵體係搭建、定時取樣規劃以及樣品預處理
長時間發酵培養
提前活化菌種，按照固定接種比例接入滅菌後的發酵培養基，放置恒溫搖床，設置轉速、溫度進行長時間振蕩發酵。根據預估完整生長周期設定總發酵時長，例如120 h連續培養。
實驗組設置
空白對照組為經過滅菌、沒有接入菌種的空白培養基，放置和實驗組一致的搖床環境，同樣每2 h進行一次取樣處理，用來排除培養基營養鹽自然帶來的界麵活性幹擾。
發酵實驗組設置3組生物學平行搖瓶，降低隨機誤差。
每2 h取樣操作流程
設置定時鬧鍾，每隔2 h在超淨工作台內無菌取樣，單次取樣體積預留出離心、複測所需用量；取樣動作迅速，減少搖瓶開蓋時長，防止雜菌汙染。
發酵上清預處理
1.取出新鮮采集的發酵原液，8000 r/min離心15 min，沉降菌體、固體沉澱物，緩慢吸取上層澄清發酵上清；
2.上清液肉眼觀察存在細小菌體碎屑時，選用0.22 μm水係濾膜緩慢過濾；上清清澈透亮就跳過過濾步驟，防止疏水生物表麵活性劑被濾膜吸附；
3.待測上清放置至檢測溫度之後低速超聲脫氣8 min，除去溶液內部微小氣泡，超聲功率調低，規避樣品升溫加速活性物質分解；
4.取樣之後立刻上機測定，若短時間內無法檢測，樣品放置4 ℃環境臨時保存，存放時長不得超過8 h；
5.顛倒混勻離心管的時候動作輕柔，禁止劇烈搖晃產生大量氣泡。
3.預實驗基線驗證
取空白發酵培養基上機運行90 min動態張力檢測，確認張力曲線平穩，不會出現持續性下降，培養基組分不存在明顯表麵活性。
選取發酵中後期樣品開展預測試，確認探針潤濕正常，儀器可以捕捉胞外分泌物引發的表麵張力下降信號。
三、標準化上機檢測完整操作流程
1.單通道Epsilon動態張力檢測流程
吸取150 μL脫氣後的發酵上清，沿著石英樣品杯內壁緩慢加注，液麵不能出現氣泡，帶有氣泡的樣品作廢重新製備。
樣品杯安放於帕爾貼恒溫基座，關閉防風罩靜置10 min，穩定氣‑液界麵的溫度和狀態。
開啟軟件動態表麵張力采集程序，采集時長設置90 min，保存張力‑時間動態曲線，讀取吸附飽和之後的平衡表麵張力數值；如需油水界麵動力學，則添加對應油相測定液‑液界麵張力。
一份樣品測試結束之後升起探針，火焰灼燒清理附著物，倒掉廢液、清洗晾幹樣品杯之後檢測下一個時間節點樣品。
2.Delta‑8高通量定時樣品篩查流程
將每2 h收集完畢的待測上清依次添加進96孔低吸附微孔板，每孔添加50 μL樣品；微孔板加蓋避光恒溫靜置平衡30 min。
將微孔板放置恒溫載板，啟動自動序列檢測程序，每一個微孔重複測量三次，取檢測平均值。
整塊微孔板檢測結束之後執行探針陣列高溫灼燒清潔；批次檢測間隙放入空白培養基對照孔，監控基線漂移情況。
3.平行樣品質控標準
同一個取樣時間點三份平行發酵上清，三次技術平行平衡表麵張力差值大於0.5 mN/m，樣品需要重新離心脫氣複測。
全部時間節點樣品的檢測溫度、界麵靜置時長、探針下落參數、采樣間隔保持統一，保證整條動力學曲線的數據具備可比性。
4.實驗收尾和儀器養護
全部時間梯度樣品檢測結束之後反複灼燒探針，去除胞外多糖、生物表麵活性劑殘留物；樣品容器乙醇浸泡清洗，純水衝洗晾幹。導出所有取樣時刻對應的平衡張力、動態吸附曲線，一一對應記錄取樣時間、發酵液pH、菌體OD值，探針幹燥防塵存放。
四、數據處理與發酵動力學結果解析
1.關鍵界麵參數提取
從每一個時間節點的動態張力曲線提取界麵吸附誘導時長、張力下降速率、平衡氣‑液表麵張力、油水界麵平衡張力。以發酵時間作為橫坐標，平衡表麵張力作為縱坐標，繪製長時間發酵界麵張力動力學變化曲線。
2.分階段解讀張力變化規律
延滯期：菌株適應新環境，胞外活性物質分泌量很低，發酵上清表麵張力和空白對照組幾乎沒有差別。
對數生長期：菌體快速增殖代謝，大量釋放兩親性胞外分泌物，表麵張力快速下降，張力下降速率到達峰值。
穩定期：菌體數量維持穩定，生物表麵活性劑持續累積直至達到臨界膠束濃度，平衡界麵張力降到最低值並且短期維持平穩。
衰亡期：菌體發生裂解，部分胞外活性劑被胞外酶分解消耗，界麵張力開始逐步回升。
3.發酵工藝參數確定
根據動力學曲線當中張力最低點對應的取樣時間，確定最佳發酵收獲時長；對比多組平行搖瓶的曲線差異，評估菌種產表麵活性劑穩定性。後續可依托該實驗開展溫度、pH、碳氮源條件優化。
五、關鍵實驗控製要點
1.發酵上清當中黏性胞外代謝物極易附著金屬探針，每一次樣品測試結束都必須灼燒清潔探針；檢測順序遵從取樣由早到晚，減少高濃度活性物質殘留汙染早期低活性樣品。
2.全程檢測溫度恒定不變，溫度波動會改變表麵活性劑分子擴散速度、膠束聚集形態，造成不同取樣時間的數據偏差。
3.每隔2 h取樣全程無菌操作，長時間發酵極易滋生雜菌，雜菌代謝物會幹擾上清界麵張力數值。
4.樣品混勻過程輕柔操作，人為產生氣泡會消耗溶液內部的兩親分子，動態吸附動力學曲線發生失真。
5.上清液體清澈就省去過濾工序，疏水脂肽、糖脂類活性物質極易吸附在濾膜，測出的表麵張力偏高，低估菌株產活性物水平。
6.長時間檢測關閉儀器防風罩，降低水分揮發引發上清濃縮；同步測定菌體OD600、pH，把菌體生長環境參數和界麵張力動力學進行聯合分析。
